Enterobacteria, đặc biệt là Escherichia và Salmonella, là những tác nhân chính gây nhiễm trùng đường tiêu hóa (GIT) của cả người và động vật. Động vật nhiễm trùng với những vi khuẩn này, đặc biệt là gia súc, gia cầm, không chỉ gây ra thiệt hại về kinh tế cho người sản xuất, mà còn là nguồn cung cấp thịt bị ô nhiễm là nguồn gây bệnh thực phẩm ở người...

Để xác định nhiễm trùng trong GIT, các vi khuẩn này phải gắn với các tế bào đích như enterocytes, tế bào M, hoặc các đại thực bào. Nhiều thành viên trong họ Enterobacteriaceae có fimbriae type-1 hoặc pili (Fader và cộng sự, 1982; Kohno và cộng sự, 1984; Korhonen và cộng sự, 1980, Salit và Gotschlich, 1977), những cấu trúc cứng và giống như tóc thể hiện có lông trên bề mặt của vi khuẩn (Brinton, 1965, Duguid và cộng sự, 1966).

      Fimbriae loại 1 khác với các loại fimbriae khác trong khả năng dính kết hồng cầu, nhưng kết tập này có thể bị chặn bởi α-D -mannoza (Clegg và Gerlach, 1987). Mặc dù tổ chức đoạn ADN chứa gien mã hoá sản phẩm protein liên quan đến tổng hợp fimbriae loại 1 ở các vi khuẩn khác không là đồng nhất (Clegg và những người khác, 1987 ; Orndorff và Falkow, 1984 ).

      Cấu trúc cơ bản của tất cả fimbriae loại 1 gồm FimA và FimH:

      - FimA là thành phần chủ yếu của fimbriae loại 1. Hàng ngàn bản sao của FimA, còn được gọi là pilli, trùng hợp xoắn ốc để tạo ra 1 pilus (Orndorff và Falkow, 1985) có tính chất cực kỳ ổn định như được biểu thị bằng tính kháng 6M urê, hòa tan bằng natri dodecyl sulfat (SDS) và thủy phân bằng trypsin (McMichael và Ou, 1979, Salit và Gotschlich, 1977). Bản sao của gien fimA, mã hoá cho pilin protein, được kiểm soát bằng sản phẩm của gien fimB và fimE (Blomfield và cộng sự, 1991).

      - FimH là một thành phần nhỏ của fimbriae loại 1. Nằm ở đầu pilus và là thành phần trung gian gắn kết vi khuẩn với tế bào chủ (Abraham và cộng sự, 1987, Hanson và Brinton, 1988, Jones và cộng sự, 1995). Sự gắn kết của vi khuẩn đối với tế bào chủ qua FimH đã được chứng minh là đặc hiệu mannoza (Abraham và cộng sự, 1988, Krogfelt và cộng sự, 1990, Ofek et al., 1977).

      Một số nghiên cứu cho thấy sự giảm độ bám dính của vi khuẩn fimbrial loại 1 đối với các biểu mô của tế bào ruột non với sự có mặt của đường mannose hoặc các dẫn xuất của nó (Ofek et al., 1977; Oyofo và cộng sự, 1989a). Do đó, dường như mannose có thể được sử dụng như một tác nhân trị liệu để ngăn ngừa hoặc điều trị các nhiễm khuẩn do vi khuẩn enterobacteria.

      D-Mannose là một aldohexose trong mannans, tìm thấy trong polysaccharides, trong các thực liệu có nguồn gốc thực vật có khả năng tiêu hóa kém và sự hấp thụ từ đường ruột của gia cầm (Bogner, 1961). Việc bổ sung mannose tổng hợp hoặc tinh khiết có thể là một cách tiếp cận tốn kém trong nỗ lực làm giảm sự xâm chiếm của mầm bệnh của GIT. Mannan có thể ức chế sự kết hợp của E. coli với các tế bào đích (Bar-Shavit và cộng sự, 1980). Vách ngoài của nấm men như Saccharomyces (Lipke và Ovalle, 1998) hoặc Candida (Kapteyn và cộng sự, 1995) cung cấp một nguồn giàu manan. Các tế bào nấm đã được chứng minh là có khả năng gắn kết một số vi khuẩn, và sự kết dính này bị chặn bởi D-mannose hoặc các dẫn xuất của nó (Eshdat và cộng sự, 1981; Mirelman và cộng sự, 1980). Điều này cho thấy mannan tế bào nấm men đã đủ để gắn các vi khuẩn fimbrial loại 1 và có thể cạnh tranh, D-mannose có thể ngăn chặn sự kết hợp do nấm men gây ra bởi vì D-mannose sẽ gắn kết với vi khuẩn.

      Nghiên cứu dưới đây với mục đích so sánh khả năng của các sản phẩm thành tế bào nấm men khác nhau kết hợp Escherichia coli và Salmonella typhimurium (S. typhimurium) trong các thử nghiệm in vitro.

Vật liệu và phương pháp

Các sản phẩm thành tế bào nấm men và các chủng vi khuẩn

      Sáu sản phẩm thành tế bào nấm men, được chỉ định là A-F, đã được thử nghiệm cho hoạt động ngưng kết – gây ra hoạt tính trên E. coli và S. typhimurium.

- Sản phẩm A gồm có 14% mannan và 20% β-glucan

- Sản phẩm B chứa 11% mannan và 37% β-glucan

- Sản phẩm C có 24-26% mannan và 22-24% β-glucan

- Sản phẩm D bao gồm 6.2% mannan và 32% β-glucan

- Sản phẩm E bao gồm 45% mannan và 30% β-glucan

- Sản phẩm cuối cùng, sản phẩm F chứa 11% mannan và 33% β-glucan

      Các sản phẩm này được hòa tan với nước cất để đạt được nồng độ 100 mg/ml.

      Vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm này là phân lập VPI của một E. coli gây bệnh và một NalR/Novr S. typhimurium. Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường LB ở 37^oC và được khuấy ở tốc độ 130 vòng/phút trong máy lắc qua đêm. Số lượng vi khuẩn cấy qua đêm được thu hoạch bằng cách quay ở tốc độ 1500 vòng/phút trong máy ly tâm và rửa hai lần với PBS, pH 7,2. Phần vi khuẩn lắng đọng sau ly tâm đã được pha loãng với PBS và nồng độ vi khuẩn được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 600 nm và điều chỉnh tới 10¹⁰ tế bào/mL. Vi khuẩn được giữ trên đá lạnh cho đến khi sẵn sàng sử dụng trong cùng một ngày.

Phân tích kết tập

      Sự kết tập các vi khuẩn bằng các sản phẩm nấm khác nhau đã được kiểm tra như đã mô tả trước đó (Peng và cộng sự, 2001) với một số thay đổi nhỏ. Tóm lại, trong một ống 15 mL, 200 μl dịch pha loãng vi khuẩn đã được thêm vào 2 mL dung dịch muối đệm phosphate (PBS, Sigma, # P4417), pH 7.2, sau đó thêm 1,8 mL dung dịch thể vẩn tế bào nấm men hoặc PBS.

      Sự kết tụ của mỗi sản phẩm nấm đã được thực hiện trong ba lần. Các ống sau đó đã vortex để trộn đều trong 10 phút. Sau khi trộn, dung dịch huyền phù được cho lắng trong 10 phút trước khi lấy 3.5 mL dung dịch trên và đưa vào một ống mới. Nước đã được thêm vào dung dịch trên đã được gỡ bỏ để mang lại thể tích lên đến 4 mL. Huyễn dịch này được chỉ định là A. Khối lượng của kết tủa còn lại cũng tăng lên với 3.5 mL nước để tăng thể tích lên đến 4 mL. Huyễn dịch này được chỉ định là B. Lượng chất kết tụ trong ống được PBS bổ sung thay cho sản phẩm nấm men cũng được đưa lên đến 4 mL, và ống này được chỉ định là C.

      Các ống được trộn lẫn để đồng nhất hoá huyễn dịch. Mật độ của huyền phù được đo bằng cách đọc độ hấp thụ ở 600 nm bằng quang phổ kế. Hoạt tính kích thích kết dính của các sản phẩm nấm được tính như tỷ lệ phần trăm các tế bào vi khuẩn kết tụ trong hệ thống sản phẩm nấm, biểu hiện như (ODB-ODC)/(ODA + ODB) x 100%. Phép thử kết tập được lặp lại hai lần khi E. coli được sử dụng và ba lần với S. typhimurium. Thử nghiệm được thực hiện nhân bản cho mỗi sản phẩm tại mỗi lần thử.

Phân tích ức chế ngưng kết

      Các thử nghiệm ức chế kết tập được thực hiện để kiểm tra xem sự ràng buộc của các sản phẩm men này với vi khuẩn được trung gian bởi dư lượng mannose. Phép khảo nghiệm này về cơ bản tương tự như phương pháp kết tập được mô tả ở trên, ngoại trừ 100 μl mannose 1 mg/mL được đưa vào ống có chứa 2 mL PBS cùng với 200 μl huyễn dịch vi khuẩn, và 1.7 mL dung dịch nấm đã được sử dụng.

Kết quả

      Hình 1 và 2 thể hiện hoạt tính kích thích kết dính của các sản phẩm thành tế bào nấm men khác nhau khi khảo nghiệm kết tập được thực hiện bằng cách sử dụng E. coli và S. typhimurium. Tất cả các sản phẩm thành tế bào nấm đã có thể kết hợp cả E. coli và S. typhimurium. Nhìn chung, khả năng của các sản phẩm này gắn kết với S. typhimurium thấp hơn một chút so với khả năng kết hợp với E. coli.

      Sản phẩm B cùng với Sản phẩm E và Sản phẩm A nằm trong số các sản phẩm có hoạt tính kích thích kết dính mạnh nhất (trên 70%) đối với E. coli. Tỷ lệ tổng hợp các tế bào với ba sản phẩm này cao hơn đáng kể so với các sản phẩm F, sản phẩm D, và sản phẩm C. Sản phẩm F và sản phẩm C cho thấy hoạt tính gây kết tập ở E. coli với tỷ lệ tổng hợp tế bào lần lượt là 68,53% và 60,27%. Sản phẩm D được tìm thấy có tỷ lệ tổng hợp tế bào E. coli thấp nhất với 45.69%.

 

      Sản phẩm E và sản phẩm A thể hiện hoạt tính gây kết tụ cao nhất trên S. typhimurium (lần lượt là 69.60% và 68.90%) so với tất cả các sản phẩm khác. Sản phẩm F, sản phẩm B và sản phẩm C cho thấy hoạt tính ức chế kết tập vừa phải đối với S. typhimurium với tỷ lệ tập hợp tế bào là 61.67%, 57,69% và 58,91%. Sản phẩm D kích thích kết tụ yếu nhất trên S. typhimurium với phần trăm tập hợp tế bào chỉ có 45.90%.

 

      Với sự có mặt của mannose, tỷ lệ tổng hợp tế bào của tất cả các sản phẩm thành tế bào nấm men với cả hai vi khuẩn đã được giảm đáng kể (Hình 3 và 4).

 

 

Thảo luận

      Sự gắn kết của vi khuẩn vào các tế bào đích, chẳng hạn như tế bào ruột, tế bào M và các đại thực bào, là một bước cơ bản để tạo ra vi khuẩn trong đường tiêu hóa. Enterobacteria biểu hiện fimbriae loại 1 trên bề mặt tế bào của chúng sử dụng FimH, một thành phần nhỏ của fimbriae loại 1, liên kết với các dư lượng mannose được biểu hiện trên bề mặt tế bào đích (Abraham và cộng sự, 1988; Krogfelt và cộng sự, 1990). Mannose hoặc các dẫn xuất của nó như α-D-mannopyranoside đã được chứng minh là có khả năng ngăn chặn hoặc làm giảm sự bám dính enterobacteria với các tế bào biểu mô trong ruột (Ofek và cộng sự, 1977; Oyofo và cộng sự, 1989b). Tầm quan trọng của công việc nói trên là mannan trong các tế bào nấm men, giàu và nguồn mannan rẻ tiền, có thể được sử dụng để liên kết và kết hợp nhiều chủng E. coli và Salmonella (Spring và cộng sự, 2000).

      Chúng tôi thấy rằng cả sáu sản phẩm dính kết được cả hai vi khuẩn thử nghiệm. Hoạt tính kích thích kết dính của tất cả các sản phẩm nấm trên S. typhimurium thấp hơn một chút so với E. coli. Kết quả này có thể phản ánh sự thay đổi trong thành phần của fimbriae loại 1 ở các chi khác nhau của vi khuẩn trong họ Enterobacteriaceae như là tổ chức của các gen mã hoá các thành phần liên quan đến sự tổng hợp fimbrial loại 1 của những vi khuẩn này không giống nhau (Clegg và cộng sự, 1987).

      Sản phẩm B, Sản phẩm E và Sản phẩm A là sản phẩm gây ra sự kết tập mạnh nhất các tế bào E. coli với tỷ lệ tổng hợp tế bào trên 70%. Sản phẩm E và Sản phẩm A thể hiện hoạt tính gây kết tập cao nhất trên S. typhimurium. Hoạt động của sản phẩm B ít hơn 10% so với sản phẩm E và sản phẩm A trong trường hợp S. typhimurium. Sản phẩm B, Sản phẩm E và Sản phẩm A chứa 11%, 45% và 14% mannan. Sản phẩm F và Sản phẩm C cho thấy tỷ lệ tổng hợp tế bào thấp hơn, và sản phẩm D có tỷ lệ phần trăm tổng hợp tế bào thấp nhất của tất cả các sản phẩm nấm được thử nghiệm. Tỷ lệ mannan trong sản phẩm F, sản phẩm C, và sản phẩm D lần lượt là 13%, 24-26% và 6.2%. Các hệ số tương quan giữa tỷ lệ phần trăm các tế bào E. coli tổng hợp hoặc S. typhimurium và tỷ lệ mannan là 0,326 (P = 0,08) và 0,421 (P = 0,004), tương ứng (Bảng 1). Những dữ liệu này chỉ ra rằng số lượng manan trong các sản phẩm nấm men là một phần chịu trách nhiệm về khả năng của các sản phẩm nấm men kết tụ vi khuẩn fimbrial loại 1.

      Như đã được báo cáo trước đây bởi một số nhà nghiên cứu, ràng buộc với các sản phẩm nấm này đối với E. coli và S. typhimurium đã được quyết định bởi mannose vì tỷ lệ tổng hợp tế bào của tất cả các sản phẩm giảm đáng kể khi bổ sung mannose. Tuy nhiên, tỷ lệ hàm lượng manan không phải là lý do hoàn toàn cho việc kết hợp các tế bào vi khuẩn. Một số sản phẩm có tỷ lệ manan thấp hơn, nhưng vẫn có khả năng dính kết nhiều tế bào vi khuẩn hơn so với các phân tử có tỷ lệ manan cao hơn. Do đó, các yếu tố khác như số lượng mannose dư lượng trên oligosaccharide hoặc các loại liên kết glycosydic dường như ảnh hưởng đến khả năng của các sản phẩm nấm liên kết và kết dính vi khuẩn. Tỷ lệ β-glucan không cho thấy bất kỳ mối tương quan nào với hoạt tính kích thích kết dính của các sản phẩm nấm được kiểm tra vì hệ số tương quan giữa tỷ lệ phần trăm E. coli tổng hợp và tỷ lệ phần trăm của glucan -0,029 (P = 0.88) (Bảng 1). Điều thú vị là tỷ lệ β-glucan cho thấy tương quan nghịch với tỷ lệ phần trăm S. typhimurium tổng hợp với hệ số tương quan là -0.293 (P = 0,05) cho thấy tác dụng ức chế của β-glucan đối với hoạt tính gây kích thích của các sản phẩm thành tế bào nấm men trên vi khuẩn này.

 

Kết luận

      Các kết quả từ nghiên cứu này cho thấy rằng tất cả các mannan có chứa các sản phẩm thành tế bào nấm men được sử dụng trong nghiên cứu này đều có khả năng gây ra sự kết tập của hai loại vi khuẩn enterobacteria, E. coli và S. typhimurium. Tuy nhiên, sự khác biệt về tỷ lệ kết tập các tế bào giữa các sản phẩm khác nhau không phải là lý do duy nhất để người ta sử dụng như một công cụ để chọn sản phẩm tốt nhất để sử dụng như một phụ gia thức ăn vì pilli không phải là yếu tố duy nhất quyết định sự độc hại của vi khuẩn gây bệnh. Các yếu tố như: liệu vi khuẩn có sản sinh độc tố, loại độc tố nó sản xuất hay cấu trúc và chức năng của polysaccharide trong thành tế bào vi khuẩn cũng góp phần vào tính độc hại của vi khuẩn (Gyles, 1994). Ngoài ra, một sản phẩm thành tế bào nấm men không kết hợp tất cả các vi khuẩn gây bệnh (Spring và cộng sự, 2000). Do đó, như một tấm chắn, xét nghiệm dính kết trong ống nghiệm rất quan trọng trong việc cung cấp chỉ một số cơ sở cho hoạt động của sản phẩm MOS trong cơ thể. Với những kết quả này, bắt buộc phải thử nghiệm thực địa sản phẩm để đánh giá đầy đủ tính hiệu quả của từng sản phẩm. Việc sử dụng sản phẩm địa phương trong môi trường ống nghiệm không phải là một đánh giá dứt khoát bởi vì trong cơ thể các sản phẩm này sẽ bị ảnh hưởng bởi pH ruột, các enzym ruột và ngay cả vi khuẩn đường ruột và các sản phẩm chuyển hóa của chúng.

 

 

Lược dịch từ REDUCTION OF INFLAMMATORY RESPONSES BY MANNAN RICH FRACTION (Panthong Singbootra - North Carolina State University)